近日，公共卫生学院环境与健康研究平台（下文简称“平台”）传来捷报。在学校仪器设备开放共享基金的支持下，项目团队经过潜心钻研，成功自主研发出适用于共享平台的微生物快速检测技术。
一、十年一剑，开启平台建设新征程
平台位于rabey雷竞技同济医学院校园的公共卫生学院二号楼内，始建于2005年。平台依托环境与健康教育部重点实验室、国家环境保护环境与健康重点实验室和省部共建国家重点实验室培育基地—环境卫生学重点实验室。10余年来，平台获教育部“985工程”、“211”雷竞技注册官网、“双一流”雷竞技注册官网经费6000余万元。已建成分子毒理学实验室、分子流行病学实验室、环境流行病实验室、环境监测实验室、职业监测实验室等多个功能实验室，为持续提升环境与健康研究水平、培养相关专业研究人才提供了良好的硬件支撑。平台拥有液相色谱－串联四极杆质谱仪、超高效液相色谱/串联质谱仪、电感耦合等离子体质谱仪、高效液相色谱仪、个体采样器、遗传分析仪、实时荧光定量PCR仪、蛋白相互作用阵列系统、等离子体光谱-质谱联用仪、中通量基因分型系统和高通量基因分型系统等大型贵重仪器。此外，拥有-80℃超低温冰箱近300台，并已建成5个生物样本库。自2010年平台启动智能化仪器管理系统以来，保证了仪器设备的24小时高效运行和自动监管，为研究人员提供了全天候良好的实验环境。
平台建立了相对完善的内部管理规章制度，包括《环境与健康研究平台大型贵重仪器管理规程》、《环境与健康研究平台管理办法》、《环境与健康研究平台实验室使用规则》、《环境与健康研究平台大型贵重仪器管理规定》、《环境与健康平台指纹权限及上机卡管理规定》、《环境与健康研究平台有关工作人员职责》、《环境与健康研究平台突发安全事件应急预案》等，不仅保证了平台仪器的完好运行，也促进了平台建设的可持续发展。
图1 平台环境
二、基金助力，多技协同破解难题
在学校仪器设备开放共享基金的支持下，项目团队运用精准的分子诊断技术，涵盖基因编辑技术和PCR技术，并结合核酸快速提取、荧光定量标记等技术，研发出一套微生物精准快速检测方法。此方法能够准确鉴定5种常见的微生物，分别为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌。经证实，该套系统具备精准、便捷、简易、快速的优势。在整体设计方面，从病原体核酸检测关键技术着手进行验证：快速检测方法与确认方法的结果相互对照，从而准确评估快速检测方法的稳定性和可靠性，并为快速检测方法的协同改进提供指导。快速检测方法和确认方法相辅相成，确保了对细菌的准确检测。在核酸快速提取环节，采用快速的热裂解法提取核酸，且不会影响基因编辑酶Cas13a的活性。同时，改良了基于基因编辑的SHERLOCK方法，使之适用于平台实验环境，验证了核酸扩增和核酸检测的灵敏度与准确性。
具体研究成果如下：
1）crRNA探针设计及筛选
由于不同crRNA结合不同的靶标位点，对ssRNA的切割效率不同。分别针对5种不同细菌的保守序列，设计多crRNA探针。将设计好的crRNA序列合成，并进行crRNA体外转录和纯化。以热裂解法提取的细菌核酸为模板，利用设计的PCR引物扩增靶序列。 经过对目标细菌片段30分钟荧光强度的检测，我们筛选出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌这5种细菌扩增效率最佳的crRNA探针。
表1.使用设计5种常见目标细菌的crRNA经30分钟荧光检测值
（2）特异性评价
以待评细菌的核酸为靶核酸，以其他干扰细菌的核酸为非靶核酸，用待评价细菌的PCR引物和最优crRNA进行扩增和检测。检测步骤与crRNA筛选相同，检测时设置一组以水为模板的阴性对照，比较检测30 min时的荧光值，与阴性对照相比显著增高的为阳性（P<0.05），无显著差异的为阴性（P>0.05）。经过检测，5种目标待测细菌经过本项目设计的crRNA探针标记并扩增后，荧光强度均显著高于其它干扰细菌以及阴性对照，说明本实验方法检测目标细菌具有特异性高的特点。
表2.使用设计的5种crRNA扩增目标细菌及干扰细菌以检测其特异性
（3）灵敏度检测
热裂解法提取的细菌核酸测定其浓度，用无菌无酶水进行10倍梯度稀释，以梯度稀释的核酸为模板，分别用5种菌引物进行PCR扩增，扩增产物用各自的crRNA进行CRISPR检测。结果显示，所建立的PCR-CRISPR检测方法对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌的最低检测限分别为2、3、3、50、4拷贝/uL，荧光强度显著高于阴性对照，有统计学差异（P<0.05），验证了本方法的检测灵敏度可达10摩级别。同时，我们也初步验证，本方法可识别单碱基突变。
三、方法创新，流程优化多场景适用
本次细菌快速检测技术研究，聚焦核酸法检测微生物过程中的核心科学问题展开攻关：一方面，在参考现有核酸快速检测方法基础上推进集成创新，实现技术层面的优化升级；另一方面，针对当前基因检测系统在分析速度较慢、操作流程复杂等方面的短板，通过技术改良力求突破，让新检测系统具备操作简便直观、可满足现场化使用的优势；同时，进一步强化检测系统性能，使其拥有高速扩增、高灵敏度识别、高特异性筛查的综合能力，最终达成“一技多场景适用”的目标，为不同领域的微生物检测需求提供解决方案。
与传统的以试剂盒提取样本核酸和PCR检测目标微生物的方法相比，平台建立的检测技术操作简便，不需要具有分子生物学相关专业技能的人员操作，大幅减少了检测时长和检测费用。本项目创建了一套适用于我校公共卫生学院环境与健康研究平台的微生物即时检测技术体系，有效服务于我校相关科研人员，这一成果不仅为平台自身的微生物检测研究提供了更高效的技术支撑，拓宽了平台服务范围，也为公共卫生、环境监测、生物医药等多领域的微生物检测需求提供了优质解决方案。未来，随着该技术的进一步推广与优化，有望在更多实际场景中发挥作用，为推动相关领域科研发展注入新动能，持续彰显高校科研平台在技术创新与社会服务中的重要价值。
作者单位：公共卫生学院
撰稿：胡平
审核：郑伟
